多肽的固相合成(多肽的固相合成技術(shù))

固相合成肽的聚合物載體和連接分子

1.聚合物支持的固相合成肽需要固相載體和連接固相與反應(yīng)物的連接分子。載體和連接分子的正確選擇決定了固相合成的成功。固相合成肽的載體多為聚苯乙烯、二乙烯苯、苯乙烯共聚物等高聚物的衍生物，如氯樹(shù)脂、Pam樹(shù)脂、王樹(shù)脂、氨基樹(shù)脂等。樹(shù)脂的溶脹狀態(tài)對(duì)縮合試劑和羧基組分的自由擴(kuò)散、肽鏈間的聚集以及其他與縮合反應(yīng)有關(guān)的因素有明顯的影響。為了使載體具有良好的溶脹性能，并具有足夠大的網(wǎng)絡(luò)空以容納不斷增長(zhǎng)的更長(zhǎng)肽鏈，并便于反應(yīng)物進(jìn)入載體內(nèi)部，一般使用交聯(lián)度為1% ~ 2%的聚苯乙烯珠樹(shù)脂或微孔樹(shù)脂。

2.連接分子固相合成肽使用具有不同連接分子的聚合物，這些連接分子是含有氯甲基、巰基甲基、酰氯、對(duì)苯甲?；?、芳基磺酰氯、烯丙基、琥珀?；?、鄰硝基苯甲醇和二苯基氯硅烷的雙官能化合物。一個(gè)理想的接頭分子在整個(gè)合成過(guò)程中必須非常穩(wěn)定，并且合成后可以定量切割，不會(huì)破壞合成的目標(biāo)分子。根據(jù)與樹(shù)脂連接的肽的C-末端的結(jié)構(gòu)類(lèi)型，合適的接頭分子應(yīng)該被切割以產(chǎn)生相應(yīng)的衍生物，例如羧酸、酰胺或氨基醇。

固相合成肽的檢測(cè)

即使偶聯(lián)技術(shù)高效，也不能保證100%的?；磻?yīng)。此外，當(dāng)遇到空間位阻或β 2層狀序列時(shí)，偶聯(lián)反應(yīng)的效率大大降低。聚合物載體上總有缺失或截短的多肽鏈，它們?cè)卺尫艜r(shí)也會(huì)進(jìn)入產(chǎn)品，給分離帶來(lái)很大困難。所以固相肽合成時(shí)每個(gè)氨基酸的縮合率都要達(dá)到99.9%，尤其是長(zhǎng)肽，否則產(chǎn)品會(huì)很不純。因此，監(jiān)控每個(gè)反應(yīng)步驟的進(jìn)展非常重要。(杭州專(zhuān)肽生物有20多年的固相合成經(jīng)驗(yàn)，可以滿(mǎn)足大部分客戶(hù)的需求。)

1定性顯色反應(yīng)茚三酮顯色法(Kaiser法)，利用茚三酮顯色反應(yīng)快速確定樹(shù)脂上的氨基，從而判斷?；磻?yīng)是否完全。茚三酮法檢測(cè)聚苯乙烯樹(shù)脂中氨基的靈敏度可達(dá)5 μ mol/g，以此靈敏度可檢測(cè)縮合反應(yīng)是否超過(guò)99%。檢測(cè)茚三酮時(shí)，由于末端氨基酸殘基和序列的不同，顏色強(qiáng)度也不同。天冬氨酸(Asp)和天冬酰胺(Asn)會(huì)產(chǎn)生淡藍(lán)色或淺棕色。顯色劑2，4，62三硝基苯磺酸與樹(shù)脂上的氨基反應(yīng)呈橙紅色，靈敏度為5μmol/g樹(shù)脂。

Kaiser試劑包括:

a、6%茚三酮的乙醇溶液

b、80%苯酚的乙醇溶液

c、2%0.001MKCN的2%吡啶溶液

制備的吡啶需要用茚三酮處理，然后重新蒸熟后才能使用。檢測(cè)過(guò)程中，取少量樹(shù)脂，分別加入A、B、C各2-3滴，100℃加熱1-2分鐘。如果溶液呈藍(lán)色，或者樹(shù)脂呈藍(lán)色或紅棕色，說(shuō)明還有游離氨基；否則，連接完成。檢測(cè)游離氨基還有其他方法:三硝基苯磺酸法、苦味酸法、溴芬法等。

2游離氨基的定量測(cè)定水楊醛法用于測(cè)定肽接枝后樹(shù)脂上殘留氨基的量和除去保護(hù)基后氨基的總量?？梢远繖z測(cè)縮合反應(yīng)和脫保護(hù)基反應(yīng)是否完全。如果不完整，可以及時(shí)反復(fù)處理。用2%水楊醛+6%吡啶乙醇溶液與樹(shù)脂上的氨基反應(yīng)(60℃，30 ~ 35分鐘)。清洗后，用5%芐胺乙醇溶液(60℃，30分鐘)替換水楊醛。用芐胺乙醇溶液稀釋后，在315nm處讀取吸光值，計(jì)算氨基數(shù)量(ε = 4.33)。對(duì)于NH2大于0.15μmol/mg樹(shù)脂的樣品，該方法的相對(duì)偏差小于5%。

3部分保護(hù)的中間肽的HPLC檢測(cè)在肽合成中間，取少量肽樹(shù)脂(3 ~ 10 mg)進(jìn)行裂解，用乙醚沉淀，溶于適當(dāng)?shù)娜軇┲兄苯舆M(jìn)行HPLC分析。當(dāng)肽被切割時(shí)，N-末端保護(hù)基團(tuán)根據(jù)需要被保留或去除。當(dāng)合成的肽為短極性肽時(shí)，可以保留保護(hù)基，否則在HPLC中保留時(shí)間太短，不利于分析。這種方法雖然麻煩，但耗時(shí)短，準(zhǔn)確率高。

反應(yīng)溶劑

二甲基甲酰胺(DMF)和二氯甲烷(DCM)是多肽固相合成中常用的溶劑，尤其是DMF因其對(duì)反應(yīng)產(chǎn)物和產(chǎn)物的高溶解性而被廣泛應(yīng)用于許多反應(yīng)體系中。DMF雖然溶解度較好，但沸點(diǎn)較高，需要減壓蒸發(fā)。此外，副產(chǎn)物N-?；逶诟呓殡姵?shù)的溶劑中容易產(chǎn)生[〔DMF，乙腈(CH3CN)，二甲基亞砜(DMSO)，H2O等。]，而在低介電常數(shù)的溶劑(CH2Cl2、CCl4、C6H6等)中不易產(chǎn)生。).在非極性溶劑中，N-保護(hù)氨基酸能迅速與DCC反應(yīng)生成對(duì)稱(chēng)酸酐。所以只要能溶解反應(yīng)物，就盡量選擇介電常數(shù)低的溶劑。在固相合成中，DCM多用作溶劑，它有兩個(gè)優(yōu)點(diǎn):比DMF消旋率小，N-?；迳陕?。當(dāng)羧基成分難以溶解時(shí)，可以加入幾滴再蒸的DMF幫助溶解。

縮合劑主要有碳化二亞胺型和脲鹽型。

碳化二亞胺型

主要有DCC、DIC、EDC。HCl等。DCC用于該反應(yīng)。由于反應(yīng)生成的DCU在DMF中溶解度很小，會(huì)產(chǎn)生白色沉淀，所以一般不用于固相合成。但由于其價(jià)格低廉，在液相合成中可通過(guò)過(guò)濾除去，應(yīng)用仍相當(dāng)廣泛。因?yàn)樗乃苄?，EDC。HCl廣泛應(yīng)用于肽和蛋白質(zhì)的連接，而且相當(dāng)成功。但這類(lèi)縮合試劑最大的一個(gè)缺點(diǎn)是，如果單獨(dú)使用，副反應(yīng)會(huì)比較多。但研究表明，如果在活化過(guò)程中加入HOBt、HOAt等試劑，可以將副反應(yīng)控制在很低的范圍內(nèi)。

銨鹽型

鹽縮合試劑反應(yīng)性高，速度快，目前應(yīng)用廣泛，包括HBTU、TBTU、HATU、PyBOP等。試劑使用過(guò)程中需要添加有機(jī)堿，如二異丙基乙胺(DIEA)和N-甲基嗎啉(NMM)。只有加入試劑后，氨基酸才能被激活。

固相合成過(guò)程

1.以羥基樹(shù)脂為載體的合成方法(以王樹(shù)脂為例:圖1)

王樹(shù)脂、PAM樹(shù)脂、樹(shù)脂和Sasrin樹(shù)脂都在接頭結(jié)構(gòu)中含有苯甲醇基團(tuán)。在大多數(shù)情況下，預(yù)先形成的N-保護(hù)氨基酸的對(duì)稱(chēng)酸酐和催化劑DMAP(對(duì)二甲氨基吡啶)與羥基樹(shù)脂反應(yīng)。在這個(gè)結(jié)合反應(yīng)中。DMAP是必要的，但它也帶來(lái)一些麻煩。比如當(dāng)一些空間位阻大、反應(yīng)活性低的Fmoc-氨基酸需要較長(zhǎng)的反應(yīng)時(shí)間，DMAP的純度不理想時(shí)。一些Fmoc基團(tuán)被除去并產(chǎn)生一些二肽。更常見(jiàn)的危險(xiǎn)是，當(dāng)Cys和His作為C端第一個(gè)氨基酸與羥基樹(shù)脂反應(yīng)時(shí)，DMAP傾向于將這兩個(gè)氨基酸外消旋化。所以解決的辦法就是用Cl-Trt樹(shù)脂把這兩個(gè)氨基酸鍵合起來(lái)，也可以產(chǎn)生酯基接頭。另一種解決方法是使用MSNT試劑[Fra I388，Ren 1998]，可以有效避免Cys和His與各種羥基樹(shù)脂鍵合時(shí)的外消旋化危險(xiǎn)。

圖1固相肽合成

2.以三苯甲基樹(shù)脂為載體的合成方法(圖2)

三芐基(trt)樹(shù)脂含有三芐基結(jié)構(gòu)，因此具有很高的反應(yīng)活性。通常，將等摩爾量的受保護(hù)氨基酸和4倍量的DIEA與Trt樹(shù)脂在二氯甲烷中混合，在室溫下30-12分鐘后反應(yīng)完成。對(duì)于沒(méi)有完全反應(yīng)的位點(diǎn)，可以用甲醇封閉?；赥rt連接體的溫和鍵合和溫和裂解的特性，在這種樹(shù)脂上濃縮皮片和制備完全保護(hù)的皮片是一種理想的方法。

圖2固相肽合成

FMOC固相合成谷氨酸色氨酸

作為載體的氨基樹(shù)脂的合成方法

MBHA樹(shù)脂、PAL樹(shù)脂、Knorr樹(shù)脂、Rink-NH2樹(shù)脂等。都含有能與連接基中的羧酸反應(yīng)的氨基。在C-末端結(jié)合第一個(gè)氨基酸的反應(yīng)條件與肽接枝循環(huán)中的反應(yīng)條件完全相同。如果DCC用作縮合劑，通常，N-保護(hù)的氨基酸與DCC和HOBT在溶劑(DMF、THF、DCM等)中混合。)生成HOBT活性氨基酸酯，靜置3-5小時(shí)?；罨磻?yīng)基本完成后，濾出副產(chǎn)物DCU沉淀，將羧基活化組分溶液與氨基樹(shù)脂混合進(jìn)行鍵合反應(yīng)。這個(gè)反應(yīng)有兩點(diǎn)值得注意:①大部分氨基樹(shù)脂的氨基都不是以游離狀態(tài)出售的。一些氨基以鹽酸鹽的形式存在，而另一些氨基則具有臨時(shí)保護(hù)基團(tuán)(如Fmoc、Boc等。).因此，在與C-末端的第一個(gè)氨基酸結(jié)合之前，必須進(jìn)行相應(yīng)的中和或去除臨時(shí)保護(hù)基團(tuán)。②氨基酸活化組分的用量應(yīng)遠(yuǎn)高于氨基樹(shù)脂組分的用量，一般摩爾比為(2-5): 1，才能使鍵合反應(yīng)接近100%，因?yàn)槲歹；陌被鶚?shù)脂不能從產(chǎn)物中除去。使用大量過(guò)量的結(jié)構(gòu)單元是所有固相有機(jī)合成中常見(jiàn)的。

除了DCC，其他常見(jiàn)的冷凝劑有DIC、EDC、EEDQ、HBTU等。