薄層色譜法(薄層色譜法的分析方法)

一.定性分析

1.用保留值定型在特定的色譜系統(tǒng)中，化合物的R f值是常數(shù)。將未知物質(zhì)的R f值與標準物質(zhì)的RF值進行比較，可以作為鑒定未知物質(zhì)的依據(jù)。通過顯色等方法進行定性分析和定位后，測量斑點的R f值。與同一塊板上已知參考點的R f值比較，R f值一致，可以初步確定該點和參考點是同一物質(zhì)。然后更換幾個展開系統(tǒng)，如果R f值還是一樣的話，可以得到更為積極的定性結(jié)論。這種定性方法適用于已知范圍內(nèi)的未知對象。由于R f值的重復性差，很難對其進行表征，所以常采用相對rf值RS來表征。

2.在板上表征化學反應有兩種方式:①反應后生成具有特征顏色的化合物，從而鑒別反應物；②反應后形成成分不明的復雜混合物，但可根據(jù)產(chǎn)物的“指紋”特征進行鑒定。除上述兩種定性方法外，還有車載光譜定性分析、薄層色譜與其他聯(lián)用技術(shù)間接定性、薄層色譜-紅外光譜與定性分析聯(lián)用、薄層色譜-質(zhì)譜與定性分析聯(lián)用。取下分離區(qū)，洗脫，再用紫外可見分光光度法、紅外分光光度法等其他方法進一步定性分析。

第二，定量分析

由于諸多因素，色譜條件的一致性很難控制。例如，樣品量的準確性、顯影后斑點面積的規(guī)律性和測量方法的準確性等。，使薄層色譜定量分析處于“半定量”或有限檢查階段。用薄層掃描儀等儀器直接測定定量含量更準確，也可將斑點分離后洗脫，再用紫外-可見分光光度法、氣相色譜法等儀器定量。

1.用目測比較法半定量地將不同量的對照品配制成系列溶液和樣品溶液，定量地涂于同一薄層上。點樣時，嚴格控制樣品量，可以使用微量點樣器。顯色后，用目測法比較色斑的顏色深淺和面積，得出樣品的大致含量。在嚴格控制操作條件下，色斑的顏色和面積會隨著溶解質(zhì)量的變化而變化。目測對比分析的精度為±10%。

2.用洗脫法在薄層斑點線上對樣品溶液進行定量，對照品稱為斑點兩側(cè)的定位標記。展開后，只有兩邊的對照物質(zhì)被著色。定位后，如果是軟板，被測物質(zhì)在薄板中部的區(qū)域可以被捕捉器收集；如果是硬板，可以用工具定量去除樣品區(qū)，然后用合適的溶劑洗脫，再用其他化學或儀器方法定量，如重量法、分光光度法、熒光法等。使用洗脫法定量時，注意收集洗脫的空白色作為對照。定量薄層色譜要求顯色斑點集中，無拖尾現(xiàn)象。洗脫時，需要浸泡在對被測物質(zhì)有較大溶解度的溶劑中，多次洗脫，達到定量洗脫。對于一些吸附性強、洗脫困難的組分，可采用離心分離或過濾的方法進行定量洗脫。

3.薄層掃描法是指在薄層色譜中，用一定波長的光照射薄層板，掃描具有紫外或可見光吸收的斑點或經(jīng)照射可激發(fā)產(chǎn)生熒光的斑點，用色譜法定量掃描圖譜和積分值的方法。薄層掃描儀是一種直接掃描斑點以滿足薄層色譜要求的分光光度計。其中常用的是雙波長薄層色譜掃描儀，其結(jié)構(gòu)和原理與雙光束雙波長分光光度計相同。下圖顯示了其光學系統(tǒng)的結(jié)構(gòu)。

雙光束雙波長薄層掃描儀

L-光源；MC-單色儀；CH-chopper；P-薄層板；PM光電探測器

光源L(氘燈、鎢燈或氙燈)發(fā)出的光被單色儀MC(由光柵和狹縫組成)分成波長不同的兩束光λ1和λ2。斬波器CH交替遮斷這兩束光，最終在同一光路上合成，通過狹縫照射在薄板P上。如果在反射測量時，光束射到薄層板上的斑點之前的一部分光被應時窗板反射并被監(jiān)測光電管接受，另一部分照射到斑點上，除一部分光被樣品吸收外，散射光被反射光電管接受，兩個探測器的輸出信號之比被對數(shù)轉(zhuǎn)換器轉(zhuǎn)換為吸光度信號；如果在透射測量中用透射光電管代替反射光電管，其輸出信號與監(jiān)測光電倍增管的輸出信號之比將進行對數(shù)轉(zhuǎn)換，得到透射測量的吸光度信號。該信號可由儀器處理以獲得輪廓或峰面積。

對于兩種波長的選擇，可以原位掃描待測斑點，根據(jù)斑點的吸收曲線，選擇斑點的最大吸收峰波長作為測量波長λ s。選擇點吸收光譜的基線部分，即化合物的非吸收波長作為參比波長λR，如下圖所示。

斑點的吸收光譜

λ是測量波長；r是參考波長。

采用雙波長掃描，從λS掃描的測量值中減去λR掃描的測量值(斑點位置空白色薄層的吸收值)，從而補償薄層的背景不均勻性，使掃描曲線基線穩(wěn)定，提高測量精度。下圖是用λS475 nm和λR678 npH單波長和λS和λR雙波長掃描一些胡蘿卜色素化合物得到的掃描曲線。從圖中可以看出，下圖顯示

單波長掃描和雙波長掃描的比較

①雙波長掃描曲線；②和③是單波長掃描曲線。